萤火虫发光细胞内的主要物质是荧光素和荧光酶。萤火虫发光细胞内的荧光素在发光时是会被消耗的，补充的是高能化合物三磷酸腺苷。荧光素对于三磷酸腺苷极为敏感，每次发光后，只要加入一点三磷酸腺苷，就可以重新产生荧光。
萤火虫是一种躯体翅鞘柔软、完全变态的甲虫，一生历经卵、幼虫、蛹及成虫四个时期。全世界约有2000多种萤火虫。目前已知的萤火虫种类，其幼虫都会发光，一般幼虫的发光器位于第八腹节的两侧，在夜间活动时发光。至于成虫会不会发光，则要视种类而定;例如弩萤属的萤火虫，虽然幼虫会发光，但是雌雄成虫都不会发光。
萤火虫的发光，简单来说，是荧光素在催化下发生的一连串复杂生化反应;而光即是这个过程中所释放的能量。由于不同种类的萤火虫，发光的型式不同，因此在种类之间自然形成隔离。萤火虫中绝大多数的种类是雄虫有发光器，而雌虫无发光器或发光器较不发达。虽然我们印象中的萤火虫大多是雄虫有两节发光器、雌虫一节发光器，但这种情况仅出现于熠萤亚科中的熠萤属及脉翅萤属。因为像台湾窗萤，雌雄都有两节发光器，两者最大的区别在于雌虫为短翅型，而雄虫则为长翅型。
萤火虫的发光器是由发光细胞、反射层细胞、神经与表皮等所组成。如果将发光器的构造比喻成汽车的车灯，发光细胞就有如车灯的灯泡，而反射层细胞就有如车灯的灯罩，会将发光细胞所发出的光集中反射出去。所以虽然只是小小的光芒，在黑暗中却让人觉得相当明亮。而萤火虫的发光器会发光，起始于传至发光细胞的神经冲动，使得原本处于抑制状态的荧光素被解除抑制。
萤火虫的发光细胞内有一种含磷的化学物质，称为荧光素，在荧光素的催化下氧化，伴随产生的能量便以光的形式释出。由于反应所产生的大部分能量都用来发光，只有2~10%的能量转为热能，所以当萤火虫停在我们的手上时，我们不会被萤火虫的光给烫到，所以有些人称萤火虫发出来的光为“冷光”。
至于萤火虫发光的目的，早期学者提出的假设有求偶、沟通、照明、警示、展示及调节族群等功能;但是除了求偶、沟通之外，其它功能只是科学家观察的结果，或只是臆测。萤火虫于夜晚的发光行为，以黑翅萤为例，就目前的研究发现，多是在日落后，雄虫开始在栖地上边飞边亮;在雄虫开始活动不久后，雌虫便开始出现于栖地周围的高处(雌虫也会发光，但只有发光器一节，雄虫则有两节发光器)，从晚上7点一直到11点半左右，在其栖地可以见到成百成千的萤火虫发光，但差不多在晚上11点半过后，成虫便逐渐停止发光。而且雄虫发光的频率也有变化，并非整晚的发光频率都一样。